Indução do sistema citocromo P450 em linhagens de hepatoma humano para utilização como modelo in vitro no desenvolvimento de fármacos / Induction of cytochrome P450 system in human hepatoma cell lines for using as in vitro model in drug development

Na etapa inicial do desenvolvimento de novos fármacos, a avaliação do metabolismo e da toxicidade é fundamental para definir seu potencial emprego como candidato a fármaco. Nestes estudos, diversos modelos in vitro são empregados, dentre eles linhagens de hepatoma humano. Entretanto, uma grande limitação ao uso deste modelo in vitro é a baixa expressão das enzimas do sistema citocromo P450. O carotenóide bixina, componente majoritário do anato (urucum), apresentou em estudos in vivo, a capacidade de induzir algumas isoformas do sistema citocromo P450, com a vantagem de apresentar baixa toxicidade. Neste trabalho, a fração lipossolúvel do anato (bixina) e hidrossolúvel (norbixina) foram avaliadas como indutores do sistema citocromo P450 em linhagens de hepatoma humano. Ensaios de MTT, empregando as linhagens HepG2, C3A e SK-HEP-1 indicaram que bixina e norbixina em concentrações abaixo de 0,22 mM são seguras quanto à citotoxicidade. A expressão dos genes CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 e 3A4 foi avaliada, através de ensaios de RT-PCR em tempo real, em linhagens de hepatoma humano submetidas a tratamento com os compostos bixina e norbixina. Os resultados mostraram que células HepG2 e C3A tratadas com bixina nas concentrações de 0,05 e 0,1 mM, por períodos de 24 e 48 horas, apresentaram aumento de expressão da CYP 1A1 e CYP 1A2. Porém, a exposição de células HepG2 e C3A ao composto norbixina não resultou em aumento de expressão das isoformas avaliadas neste estudo. Os resultados deste trabalho indicaram o potencial emprego de bixina como agente indutor das CYPs 1A1 e 1A2, em linhagens de hepatoma humano utilizadas como modelo in vitro, para estudo de compostos cuja metabolização envolva uma destas vias, entretanto, estudos adicionais são fundamentais, a fim de avaliar a ação deste composto sobre outras isoformas do sistema citocromo P-450, bem como outros sistemas enzimáticos.

In the early development stage of the new drugs, the pharmacological and toxicological properties are critical to define the potential use of the candidate drug. During this stage, several in vitro models systems are employed, including human hepatoma cell lines. However, the main limitation of the use of cell lines as in vitro model is the low expression level of cytochrome P450 enzymes. A carotenoid knowed as bixin, the main pigment in the annatto (urucum), it has been reported to induce some isoforms of cytochrome P450 in rats, with the advantage of its low toxicity. In this work, the oil-soluble (bixin) and aqueous soluble extracts (norbixin) were evaluated as inducers of the cytochrome P450 system in human hepatoma cell lines (HepG2, C3A, SK-HEP-1). The results of MTT assays showed that bixin concentrations below 0.22 mM were not cytotoxic in HepG2, C3A and SK-HEP-1 cell lines. Expression changes in CYP 1A1, 1A2, 2C9, 2B6, 2E1 and 3A4 were evaluated, by real time RT-PCR and the results showed that the exposition to 0,05 mM and 0,1 mM bixin, for 24 and 48 hours of treatment, lead to an increase in CYP 1A1 and CYP 1A2 expression level. By contrast, the cytochrome P450 isoforms were not affected by the exposition to norbixin. In conclusion, this work indicated the potential use of bixin induced hepatoma cell lines as in vitro model for studies of biotransformation and toxicity of drugs involving CYP 1A, however, further studies are necessary to evaluate the effect of bixin on the other cytochrome P450 isoforms as well as other enzymatic systems.

Evaluation of cytochrome P-450 concentration in Saccharomyces cerevisiae strains / Avaliação do citocromo P-450 na concentração de estirpes de Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae has been widely used in mutagenicity tests due to the presence of a cytochrome P-450 system, capable of metabolizing promutagens to active mutagens. There are a large number of S. cerevisiae strains with varying abilities to produce cytochrome P-450. However, strain selection and ideal cultivation conditions are not well defined. We compared cytochrome P-450 levels in four different S. cerevisiae strains and evaluated the cultivation conditions necessary to obtain the highest levels. The amount of cytochrome P-450 produced by each strain varied, as did the incubation time needed to reach the maximum level. The highest cytochrome P-450 concentrations were found in media containing fermentable sugars. The NCYC 240 strain produced the highest level of cytochrome P-450 when grown in the presence of 20 percent (w/v) glucose. The addition of ethanol to the media also increased cytochrome P-450 synthesis in this strain. These results indicate cultivation conditions must be specific and well-established for the strain selected in order to assure high cytochrome P-450 levels and reliable mutagenicity results.

Linhagens de Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente empregadas em testes de mutagenicidade devido à presença de um sistema citocromo P-450 capaz de metabolizar substâncias pró-mutagênicas à sua forma ativa. Devido à grande variedade de linhagens de S. cerevisiae com diferentes capacidades de produção de citocromo P-450, torna-se necessária a seleção de cepas, bem como a definição das condições ideais de cultivo. Neste trabalho, foram comparados os níveis de citocromo P-450 em quatro diferentes linhagens de S. cerevisiae e avaliadas as condições de cultivo necessárias para obtenção de altas concentrações deste sistema enzimático. O maior nível enzimático foi encontrado na linhagem NCYC 240 em presença de 20 por cento de glicose (p/v). A adição de etanol ao meio de cultura também produziu um aumento na síntese de citocromo P-450. Estes resultados indicam que as condições de cultivo devem ser específicas e bem definidas para a linhagem selecionada, garantindo assim elevados níveis de citocromo P-450 e, conseqüentemente, a confiabilidade nos testes de mutagenicidade.